高血压是各种心脑血管疾病发生发展的主要病因之一，预计到2025年，发病人数将超过15亿。在高血压的发病机理中，血管紧张素转化酶（ACE）起着至关重要的作用，它一方面可以催化血管紧张素I转化为血管紧张素II，另一方面它还促进缓激肽的降解，这两个行为均会引起血压的升高。因此，抑制ACE是目前临床上治疗高血压的有效方法。

中国科学院南海海洋研究所，中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室的李 姣、苏继磊、尹 浩*等人采用超滤及凝胶色谱Sephadex G-25对马氏珍珠贝肉酶解物进行初步分离，获得相对高活性的ACE抑制组分F2和F3。

本实验目的在于研究马氏珍珠贝肉在不同酶解时间下的分子质量变化，以及随着酶解时间一些特征峰的变化，并对F2、F3组分进行鉴定，从而解析酶解物中活性肽的结构特征，最后采用分子对接的方法筛选其中潜在的ACE抑制肽，对其抑制机理进行初探，以期为珍珠贝来源活性肽应用于降血压功能性食品和药品开发提供理论基础。

1、珍珠贝肉不同酶解时间样品的Tricine-SDS-PAGE

如图1所示，泳道1可以看出珍珠贝肉中的蛋白种类繁多，分子质量多集中在10～35 kDa之间。酶解2 h后大于35 kDa的条带基本消失，出现了大量小于35 kDa甚至10 kDa左右的条带。而酶解到第10小时，10～35 kDa之间的条带也消失，说明酶解产生了大量10 kDa以下的肽，这些分子质量较小的肽难以通过电泳完全跑开。在整个酶解过程中，有一条35 kDa左右的蛋白条带始终存在，推测它可能是珍珠贝肉中某种或几种难以被碱性蛋白酶酶解的蛋白。

2、珍珠贝肉酶解物的分子质量分布特征

由表1可知，酶解2 h后，蛋白可能只是初步降解，产生的肽段分子质量仍在3 000 Da以上。在酶解时间达到4 h时，产生了大量小于3 000 Da的多肽，占总量的28.39%。在酶解时间为10 h时，产生的低于500 Da小分子肽含量达到最高，为5.82%。随着酶解时间的进行，大分子蛋白含量逐渐降低，小分子肽含量逐渐升高，这是因为随着酶解的进行，已产生的长肽链，可能再次被蛋白酶切割，导致了更多小分子肽的产生。同时，由于底物的消耗，反应产物的生成，以及酶切位点的有限性，使得新的小分子肽段产生的速率变慢。

3、RP-HPLC对不同酶解时间酶解物的表征

如图2所示，可以观察到一个保留时间为20 min左右的特征峰（a），其在2、4、6、8、10 h酶解物样品中峰面积比分别为3.69%、6.49%、9.23%、10.42%、12.46%。随着酶解的进行，其相对含量越来越大，特别是从2～4 h之间增加的幅度最大。根据文献报道，具有ACE抑制活性肽的结构特点是含有大量疏水性氨基酸，这种疏水的特性会使得它们在反相柱上的保留时间相对较长，这与本研究相符，即疏水性的特征峰面积占比随着酶解时间逐渐增大。

4、珍珠贝10 h酶解物活性肽的鉴定、筛选及理化特性

在本研究中，10 h酶解物中小分子肽含量占比最大，并且据报道ACE抑制活性肽大多为小分子肽，因此，在本实验中选择10 h的珍珠贝肉蛋白酶解物继续进行研究。采用超滤及凝胶色谱法对酶解物进行初步的分离及活性跟踪，经Sephadex G-25柱洗脱后，收集了4个组分（图3），发现F2和F3组分的ACE抑制活性最强，因此采用液相色谱-串联质谱对这两个组分进行鉴定。以PEAKS Studio软件对质谱数据进行de novo测序，选择ALC值大于85%的肽段进行分析。接着以Autodock vina软件对这些肽段进行分子对接，得到的理论结合能如表2所示。同时，通过在线网站对这些肽段的等电点、净电荷及水溶性进行了预测，发现其等电点范围在0.67～10.9，净电荷在-1～1之间，水溶性大部分都不好，说明它们的疏水性强，而疏水性强的肽相对亲水肽往往具有更高的生理活性。

5、合成肽的活性验证及构效关系

结果如图4 所示，可知，除了FGPW外，PDFF、PPDPAAW、GLQW、WFHAVFW及WHAFLW均表现出不同程度的ACE抑制活性，特别是肽WFHAVFW及WHAFLW，在 1 mg/mL时，其ACE抑制率分别达到了（95.57±0.37）%及（98.59±0.08）%。因此，肽WHAFLW相比于其他合成肽具有更高的ACE抑制活性，经鉴定，其二级质谱图如图5所示。将活性最高的WHAFLW稀释一系列梯度浓度，测得其IC 50 值为52.39 μmol/L。因此，该肽可作降压药物的先导物以进行后续的研究开发。WFHAVFW及WHAFLW这两条多肽序列的共同特点是两端均有疏水性极强的Trp（W），且中间位置均包含带正电的氨基酸His（H）。

6、肽与ACE相互作用机理

本研究筛选出的2个最高活性的ACE抑制肽，即七肽WFHAVFW与六肽WHAFLW，与ACE的结合模式如图6所示。可以看出，肽WFHAVFW（绿色）与WHAFLW（蓝色）中结合能最低的构象在ACE中有一部分存在着空间重叠，说明重叠的官能团可能与ACE存在相同的作用，而从2D图可以看出，两个肽中这一重叠结构的六元环及五元环中心均与ACE的Phe391形成了Pi-Pi相互作用。

结 论

马氏珍珠贝肉蛋白是ACE抑制活性肽产生的重要来源，其酶解特征表明，合适的酶解时间可以定向产生一定分子质量的活性肽。另外，本研究还实现了传统的酶解实验与现代计算机辅助筛选技术相结合，高效筛选出了一个高活性的ACE抑制六肽，其氨基酸序列为WHAFLW，体外对ACE抑制的IC 50 值为52.39 μmol/L，对它的结构分析表明，两端具有疏水性的Trp（W），中间包含带正电的His（H），是其具有高ACE抑制活性的重要原因。

本文《马氏珍珠贝肉蛋白水解特征及其ACE抑制肽的筛选》来源于《食品科学》2022年43卷4期119-126页，作者：李姣，苏继磊，陈敏，尹浩。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210108-084。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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